SAMHD1的抗病毒作用研究.doc

摘要:目的：以MusD为研究对象检测SAMHD1抑制内源性逆转录病毒作用，从而发现SAMHD1是否抑制MusD 以及SAMHD1抑制作用的关键性位点。

方法：采用内源性逆转录病毒MusD-neo作为研究对象，其整合至宿主基因组后，可以表达neo基因，从而可以通过G418筛选检测其转座情况。MusD-neo与SAMHD1及其突变体共转染哺乳动物细胞，转染后进行G418筛选，然后观察SAMHD1抑制MusD的效果。

结果：SAMHD1抑制MuSD克隆明显。去掉其中的SAM结构域后抑制依旧明显，包含HD结构域的截断体45-626，111-626都具有抑制作用，但抑制效果不同。而去掉HD结构域后，抑制效果明显降低。说明HD结构域是SAMHD1抑制作用的关键。核定位信号突变体AAPA制作用非常明显。酶活性位点突变体233A,311A，HDAA抑制作用受到一定程度的影响。

结论：SAMHD1抑制内源性逆转录病毒明显；HD结构域是其抑制作用的关键；截断体45-626，111-626都具有抑制作用，但抑制效果不同； 

 

关键词： SAMHD1，内源性逆转录病毒, 抗病毒作用,  限制因子

 

目录

摘要

Abstract

引言-1

1 实验材料-3

1.2质粒及质粒载体-3

1.3工具酶和分子量标准-4

1.4 DNA制备试剂盒-4

1.5主要试剂和器材-4

1.6溶液配制-4

1.7 细胞系-5

2实验方法-6

2.1质粒的构建-6

2.1.1 PCR反应-6

2.1.2从琼脂糖凝胶中回收DNA片段-7

2.1.3目片段及载体DNA的酶切（NEB）-7

2.1.4  酶切产物的回收-8

2.1.5连接反应-8

2.1.6连接产物转化化学感受态细胞-9

2.1.7重组质粒的提取及定-9

2.1.8质粒的大提取-9

2.2细胞培养相关的复苏，传代，冻存-11

2.3细胞转染-11

2.4细胞裂解-12

2.5蛋白电泳-12

2.6蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素（NC）膜（湿式转膜）-13

2.7筛选拮抗G418细胞系-14

3实验结果-15

3.1 SAMHD1抑制MuSD克隆效果-15

3.2 SAMHD1及其结构域突变体抑制MuSD克隆效果-16

3.3 SAMHD1及其突变体抑制MuSD克隆效果-17

结论-20

参考文献-21

致谢-22